早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。
1．隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得*的柱效，且價(jià)格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。
2．停流進(jìn)樣。可避免在高壓下進(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)"鬼峰"；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3．閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國(guó)Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見(jiàn)），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。
六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和*裝液法兩種。①用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（zui多75％），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。②用*裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10倍（zui少3倍），這樣才能*置換定量環(huán)內(nèi)的流動(dòng)相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。
六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：①樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45µm濾膜過(guò)濾，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過(guò)泵的zui大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過(guò)高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹(shù)脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬(wàn)/米。對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對(duì)于同系物分析，只要500即可；對(duì)于較難分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬(wàn)的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長(zhǎng)就能滿(mǎn)足復(fù)雜混合物分析的需要。
柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到*效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。
kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過(guò)拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm（5~10µm），取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類(lèi)，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm，國(guó)內(nèi)有4mm和5mm），柱長(zhǎng)10~30cm；②窄徑柱（narrow
bore，又稱(chēng)細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑1~2mm，柱長(zhǎng)10~20cm；③毛細(xì)管柱（又稱(chēng)微柱microcolumn），內(nèi)徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內(nèi)徑＞5mm；⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長(zhǎng)10~30cm；⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來(lái)確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。
因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長(zhǎng)3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜（MS）聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動(dòng)相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長(zhǎng)柱達(dá)到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。
但由于柱體積越來(lái)越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測(cè)器（甚至采用柱上檢測(cè)），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測(cè)器，電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。
色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度＞20µm時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。
必須指出，液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問(wèn)題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。
無(wú)論是自己裝填的還是購(gòu)買(mǎi)的色譜柱，使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對(duì)稱(chēng)因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說(shuō)來(lái)容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以?xún)?nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。
評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、填料的種類(lèi)、粒度、色譜柱的柱效、不對(duì)稱(chēng)度和柱壓降等。
4．柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)
色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。
① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。
② 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?
③ 一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
④ 選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
⑤ 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
⑥ 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200µl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類(lèi)脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。
陽(yáng)離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、水依次沖洗。
⑦ 保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿(mǎn)乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
⑧
色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開(kāi)柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿(mǎn)色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。
通常
色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙稀Ｐ碌纳V柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。
每次工作完后，用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開(kāi)機(jī)沖洗15分鐘。
四、檢測(cè)器
檢測(cè)器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。HPLC的檢測(cè)器要求靈敏度高、噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。
1．分類(lèi)
1）按原理可分為光學(xué)檢測(cè)器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測(cè)器（如吸附熱）、
電化學(xué)檢測(cè)器（如極譜、庫(kù)侖、安培）、電學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、
放射性檢測(cè)器（閃爍計(jì)數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測(cè)器。
2）按測(cè)量性質(zhì)可分為通用型和專(zhuān)屬型（又稱(chēng)選擇性）。通用型檢測(cè)器測(cè)量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對(duì)溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。通用型的靈敏度一般比專(zhuān)屬型的低。專(zhuān)屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測(cè)器，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。
3）按檢測(cè)方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測(cè)器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測(cè)器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)器的組分的量有關(guān)。
4）檢測(cè)器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。
2．性能指標(biāo)
1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時(shí)，基線帶寬為噪音，基線在1小時(shí)內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測(cè)器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動(dòng)相從
色譜柱流入檢測(cè)器，那么它們還反映流速（泵的脈動(dòng)）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。
2）靈敏度（sensitivity）：表示一定量的樣品物質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所給出的信號(hào)大小。對(duì)濃度型檢測(cè)器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV·ml/g。對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器，它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV·s/g。
3）檢測(cè)限（detection limit）
檢測(cè)器靈敏度的高低，并不等于它檢測(cè)zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低，因?yàn)樵诙x靈敏度時(shí)，沒(méi)有考慮噪聲的大小，而檢測(cè)限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。
檢測(cè)限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(hào)（通常用2倍或3倍噪音表示）時(shí)進(jìn)入檢測(cè)器的某組分的量（對(duì)濃度型檢測(cè)器指在流動(dòng)相中的濃度--注意與分析方法檢測(cè)限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml；對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器指的是單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的量，單位g/s或mg/s）。又稱(chēng)為敏感度（detectability）。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個(gè)已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測(cè)器中來(lái)測(cè)定其檢測(cè)限的大小。
檢測(cè)限是檢測(cè)器的一個(gè)主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測(cè)器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測(cè)限除了與檢測(cè)器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件、
色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān)。
4）線性范圍（linear
range）：指檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，zui大與zui小進(jìn)樣量（濃度型檢測(cè)器為組分在流動(dòng)相中的濃度）之比。也可用響應(yīng)信號(hào)的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters
996 PDA檢測(cè)器的線性范圍是-0.1~2.0A。
定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測(cè)樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號(hào)與樣品量呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)既準(zhǔn)確又方便。但實(shí)際上沒(méi)有一臺(tái)檢測(cè)器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常A＝BCx，B為響應(yīng)因子，當(dāng)x=1時(shí)，為線性響應(yīng)。對(duì)大多數(shù)檢測(cè)器來(lái)說(shuō)，x只在一定范圍內(nèi)才接近于1，實(shí)際上通常只要x=0.98~1.02就認(rèn)為它是呈線性的。
線性范圍一般可通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。我們希望檢測(cè)器的線性范圍盡可能大些，能同時(shí)測(cè)定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測(cè)等。
5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測(cè)器的池體積都小于10µl。在使用細(xì)管徑柱時(shí)，池體積應(yīng)減少到1~2µl甚至更低，不然檢測(cè)系統(tǒng)帶來(lái)的峰擴(kuò)張問(wèn)題就會(huì)很?chē)?yán)重。而且這時(shí)池體、檢測(cè)器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計(jì)，否則會(huì)嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。
3．紫外檢測(cè)器（ultraviolet detector）
UV
檢測(cè)器是HPLC中應(yīng)用zui廣泛的檢測(cè)器，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍包括可見(jiàn)光時(shí)，又稱(chēng)為紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測(cè)器進(jìn)行微量分析。但要注意流動(dòng)相中各種溶劑的紫外吸收截止波長(zhǎng)。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì)，則會(huì)提高背景噪音，降低靈敏度（實(shí)際是提高檢測(cè)限）。此外，梯度洗脫時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生漂移。
注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長(zhǎng)，溶劑的吸光度A＝1時(shí)的波長(zhǎng)稱(chēng)為溶劑的截止波長(zhǎng)。也稱(chēng)極限波長(zhǎng)。
中國(guó)藥典對(duì)UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.40，在241~250nm范圍內(nèi)不得過(guò)0.20，在251~300nm范圍內(nèi)不得過(guò)0.10，在300nm以上不得過(guò)0.05。
UV檢測(cè)器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光透過(guò)流動(dòng)池時(shí)，若流動(dòng)相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動(dòng)池的光徑長(zhǎng)度L成正比.
UV檢測(cè)器分為固定波長(zhǎng)檢測(cè)器、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和光電二極管陣列檢測(cè)器（photodiode array
detector，PDAD）。按光路系統(tǒng)來(lái)分，UV檢測(cè)器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長(zhǎng)檢測(cè)器又可分單波長(zhǎng)（單通道）檢測(cè)器和雙波長(zhǎng)（雙通道）檢測(cè)器。PDAD是80年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道檢測(cè)器，它可以對(duì)每個(gè)洗脫組分進(jìn)行光譜掃描，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后，得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質(zhì)），色譜用于定量。常用于復(fù)雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。
4．與檢測(cè)器有關(guān)的故障及其排除
1）流動(dòng)池內(nèi)有氣泡
如果有氣泡連續(xù)不斷地通過(guò)流動(dòng)池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會(huì)在基線上出現(xiàn)許多線狀"峰"，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（不連接色譜柱）；或者啟動(dòng)輸液泵的同時(shí)，用手指緊壓流動(dòng)池出口，使池內(nèi)增壓，然后放開(kāi)?？煞磸?fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動(dòng)池破裂。
2）流動(dòng)池被污染
無(wú)論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移?？梢允褂眠m當(dāng)溶劑清洗檢測(cè)池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。
3）光源燈出現(xiàn)故障
紫外或熒光檢測(cè)器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時(shí)需要更換光源燈。
4）倒峰
倒峰的出現(xiàn)可能是檢測(cè)器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測(cè)器時(shí)，如果組分的折光指數(shù)低于流動(dòng)相的折光指數(shù)，也會(huì)出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動(dòng)相。如果流動(dòng)相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測(cè)器時(shí)，無(wú)吸收的組分就會(huì)產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動(dòng)相。在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時(shí)的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動(dòng)相不同所引起的。
五、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測(cè)信號(hào)，再手工測(cè)量計(jì)算。其后，使用積分儀計(jì)算并打印出峰高、峰面積和保留時(shí)間等參數(shù)。80年代后，計(jì)算機(jī)技術(shù)的廣泛應(yīng)用使HPLC操作更加快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、精密和自動(dòng)化，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面：①采集、處理和分析數(shù)據(jù)；②控制儀器；③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專(zhuān)家系統(tǒng)。
六、恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測(cè)器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測(cè)器的恒溫要求則更高。
溫度對(duì)溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動(dòng)相的粘度都有影響。一般來(lái)說(shuō)，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，但對(duì)分離選擇性影響不大；還可使流動(dòng)相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過(guò)程并降低柱壓。但溫度太高易使流動(dòng)相產(chǎn)生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時(shí)溫度會(huì)引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)分離有影響；但如使用硬質(zhì)填料則影響不大。
總的說(shuō)來(lái)，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對(duì)分離的影響并不顯著，通常實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行操作。在液固色譜中有時(shí)將極性物質(zhì)（如緩沖劑）加入流動(dòng)相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時(shí)溫度對(duì)保留值的影響很大。
不同的
檢測(cè)器對(duì)溫度的敏感度不一樣。紫外檢測(cè)器一般在溫度波動(dòng)超過(guò)±0.5℃時(shí)，就會(huì)造成基線漂移起伏。示差折光檢測(cè)器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測(cè)器也要求在±0.001℃以?xún)?nèi)。
